2020年版中國藥典收載了5種復方氨基酸注射液、9種多肽類藥物及1種中藥品種，均需要采用氨基酸分析方法測定藥品中氨基酸含量或氨基酸組成。為了指導藥典標準執行過程中如何選擇適宜的方法，國家藥典委員會委托中檢院牽頭承擔完成了“藥品中氨基酸分析法的建立課題”，擬定了中國藥典氨基酸分析指導原則，填補之前藥典中關于選擇測試方法的空白。

                    圖1：各國藥典介紹的氨基酸分析方法

問題來了

這么多的檢測方法應該如何選擇？

蛋白質和多肽的氨基酸分析，需要將樣品先水解成游離的氨基酸才能進行分析。由于氨基酸本身并沒有發色集團或熒光基團，所以游離氨基酸通常需要衍生化才能測定。藥品中氨基酸測定常用方法一共有6種，分別是：

① 柱前PITC衍生氨基酸測定法；

② 柱前AQC衍生氨基酸測定法；

③ 柱前OPA和FMOC衍生氨基酸測定法；

④ 柱前DNFB衍生氨基酸測定法；

⑤ 柱后茚三酮衍生氨基酸鋰離子交換系統測定法；

⑥ 柱后茚三酮衍生氨基酸鈉離子交換系統測定法。

按照衍生順序可分為柱前衍生和柱后衍生。

柱前衍生法

原理：根據氨基酸與衍生試劑反應，生成有紫外吸收的衍生物，后經反相液相色譜分離后用紫外檢測器在一定波長處檢測，在一定的濃度范圍內其響應值與氨基酸濃度成正比；

優點：對儀器配置要求不高，實驗成本低。

缺點：某些衍生物不穩定，無法定量，分離效果一般。

柱后衍生法

原理：通過調節系統pH值及離子強度，采用鋰/鈉離子交換系統，實現離子交換色譜柱對混合氨基酸的分離，經離子交換色譜分離的氨基酸與茚三酮反應，一級氨基酸生成紫色化合物，在570nm波長處有最大吸收。二級氨基酸（如脯氨酸）生成黃色化合物，在440nm波長處有最大吸收。在440nm和570nm波長處分別檢測，在一定的濃度范圍（20～500pmol）內，氨基酸衍生化產物的吸光度與氨基酸濃度成正比；

優點：自動化程度高，不易受基質干擾。

缺點：針對《氨基酸分析指導原則草案公示稿（第二次）》提到的采用柱后茚三酮衍生氨基酸鋰離子交換法，分析時間長，異亮氨酸和亮氨酸間的分離難以達到要求。改善建議采用溫度梯度可以改善分離效果。

Pickering |氨基酸分析解決方案

1、Pickering參照歐洲藥典8.0，提供了完整的氨基酸分析解決方案——

方案包括Onyx-PCX 柱后衍生儀、色譜柱和保護柱、緩沖液和茚三酮衍生試劑。

Pickering Onyx-PCX可以修改運行條件，執行溫度梯度程序，縮短運行時間加速氨基酸分離,符合歐洲藥典8.0的系統適用性要求,（亮氨酸和異亮氨酸分離度要大于1.5）。

                           表1：歐洲藥典8.0參考指南

2、分析條件：

色譜柱：高效鈉離子交換柱 4.6*110mm，貨號1154110T；

流速:0.6mL/min；

流動相:見表2；

進樣體積:50ul；

  表2：HPLC梯度程序（115411T）

3、柱后衍生條件：

柱后衍生系統:Onyx PCX；

反應器體積:0.5mL；

試劑:Trione®茚三酮 ；

反應溫度:130oC；

柱溫:見表3；

流速:0.3 mL/min；

檢測波長:UV/Vis 570nm一級氨基酸；440nm二級氨基酸。

   表3：柱溫程序

圖1：歐洲藥典8.0方法分析氨基酸的鈉柱色譜圖一 _(濃度3 ug/mL, 進樣體積50 uL)

圖2：氨基酸分析鈉柱色譜圖，以歐洲藥典8.0方法計算系統適應性檢查 _(參考表1).

Proline – 1.2 ug/mL; Isoleucine – 3 ug/mL; Leucine – 3 ug/mL; Ammonia – 0.12 ug/mL. 進樣體積50 uL.

4、結論：

今年3月份發布的針對《氨基酸分析指導原則草案公示稿（第二次）》中，以歐洲藥典為參照,填補了我國2020版藥典之前對氨基酸分析指導意見的空白，詳細的闡述了幾個常用方法的原理以及特點。Pickering參照歐洲藥典8.0，提供完整解決方案，HPLC+Onyx PCR 即可實現藥典中提到的柱后茚三酮衍生氨基酸鋰離子交換系統測定法和柱后茚三酮衍生氨基酸鈉離子交換系統測定法，實現方法擴增。

引用：氨基酸分析指導原則草案公示稿（第二次）

關于Pickering Laboratories

美國Pickering Laboratories公司是全球專業提供人工測試體液和柱后衍生化學試劑、色譜柱、分析方法等柱后衍生分析整體解決方案的機構，其不斷創新及良好的信譽被眾多的美國政府機構如EPA、ATF、FDA、AOAC和世界知名的廠商所認可。